21项注意让你更懂液相流动相

产品时间:2022-12-13 15:01

简要描述:

流动相对液相色谱行为的影响无须赘述,在设置和使用历程的一些事项要格外注意,因为实验室历程中的任何行为都可能会导致实验效果的异常。小析姐总结了关于液相色谱流动相的21项注意事项,希望可以资助你更好地相识流动相。流动相是影响液相色谱的关键因素。 一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于获得纯品和低毒性等特征。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混淆液,可是如何配制。选择配制的方法差别,分析效果特别是保留时间,是会有显著差异的。...

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本文摘要:流动相对液相色谱行为的影响无须赘述,在设置和使用历程的一些事项要格外注意,因为实验室历程中的任何行为都可能会导致实验效果的异常。小析姐总结了关于液相色谱流动相的21项注意事项,希望可以资助你更好地相识流动相。流动相是影响液相色谱的关键因素。 一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于获得纯品和低毒性等特征。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混淆液,可是如何配制。选择配制的方法差别,分析效果特别是保留时间,是会有显著差异的。

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流动相对液相色谱行为的影响无须赘述,在设置和使用历程的一些事项要格外注意,因为实验室历程中的任何行为都可能会导致实验效果的异常。小析姐总结了关于液相色谱流动相的21项注意事项,希望可以资助你更好地相识流动相。流动相是影响液相色谱的关键因素。

一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于获得纯品和低毒性等特征。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混淆液,可是如何配制。选择配制的方法差别,分析效果特别是保留时间,是会有显著差异的。高效液相色谱法中的流动相主要用水性溶剂、有机溶剂或它们的混淆液,水性溶剂也常用于缓冲液。

常因资料上表现的内容和实际的配制方法差别,而发生流动相的差异,影响了色谱图和分析效果。一般来说,溶剂的混淆按体积比(V/V)或重量比(W/W)举行。

溶液的体积因温度而变化,所以按重量比混淆可调制再现性较好的混淆溶剂,但由于操作较贫苦,通常多用体积比混淆。只要没有特别标明,就可按体积比举行混淆,但在特殊情况下,如胺类粘度高的溶液混淆时,有时用重量—体积比(W/V)的方法。液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交流而到达分散的目的,因此要求流动相具备以下的特点:a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。流动相溶解度达不到要求时,只管选用流动相中含有的比例较大的身分,以减轻进样对流动相的影响造成基线不稳。

b、流动相与样品不发生化学反映,选用流动相设置对色谱峰影响最小。c、流动相的黏度要只管小,以便获得好的分散效果;降低柱压降,延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。

如使用UV检测器,最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。流动相组成溶剂均达不到要求时,选取的溶剂应保证在设定波长内无紫外吸收。e、流动相沸点不要太低,否则容易发生气泡,导致实验无法举行。

f、在流动相配制好后,一定要举行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。下面21项注意让你更懂液相流动相。1、选择流动相应注意过滤溶剂 溶剂在使用前一定要用0.5μm的过滤器过滤,如果使用固体化学试剂(缓冲盐)配制流动相,过滤特别重要,不能让固体微粒污染泵,阻塞进样器和柱头过滤片。

本实验室有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择(反光面朝上),过滤水溶性流动相时(如甲醇/水),先用1~2mL甲醇润湿过滤膜,有助于快速抽滤。2、注意保持储液瓶的清洁 用普通溶剂瓶作流动相储液器应不定期废弃瓶子,最后一次应用HPLC级的水或溶剂清洗,不能在清洗历程中留下污迹。

3、注意保证溶剂的质量 一定要用HPLC级的溶剂,水也应到达HPLC级,同样也要使用高纯度的缓冲盐。4、注意流动相脱气不充实流动相受热,或者流动相差别组分混淆时会有气体发生,气泡进入泵内引起压力颠簸,增加噪音,色谱图上泛起毛刺。

可试用下列方法解决问题:流动相再脱气;接纳更有效的脱气方法或两种方法配合使用;改系统内混淆为系统外预混淆。HPLC所用流动相必须预先脱气,否则容易在系统内逸出气泡,影响泵的事情。系统中气泡的发生:流动相自己存在,梯度淋洗混淆后放出气泡;气泡的影响:存在于管路中,系统压力不稳定,实验效果有偏差;存在于单向阀中,易造成液体回流,流量禁绝确,甚至是不吸液存在于检测器中,泛起鬼峰,影响检测准确性。

所以做液相对流动相的气泡和杂质要求比力严格。气泡会影响柱的分散效率,检测器的敏捷度、基线稳定性,甚至使无法检测。(噪声增大,基线不稳,突然跳动)。

此外,溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至牢固相(如烷基胺)反映。溶解气体还会引起溶剂pH的变化,对分散或分析效果带来误差。溶解氧能与某些溶剂(如,甲醇、四氢呋喃)形成有紫外吸收的络合物,此络合物会提高配景吸收(特别是在260nm以下),并导致检测敏捷度的轻微降低,但更重要的是,会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰(假峰)。

在荧光检测中,溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象,特别是对芬芳烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下,荧光响应可降低达95%。

在电化学检测中(特别是还原电化学法),氧的影响更大。除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能,也将改善在一些荧光检测应用中的敏捷度。

常用的脱气方法有:加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混淆溶剂,若接纳抽气或煮沸法,则需要思量低沸点溶剂挥发造成的组成变化。(1)氦气脱气:氦气脱气是很有效的脱气方法。

氦气徐徐的通过流动相赶去溶入的空气,如果使用恰当,在10min内可除去80%~90%的溶入气体。由于氦气在流动相中的溶解度极低,所以用氦气脱气掩护的流动相可以认为是一个无气体溶解体系。其缺点是氦气价钱比力昂贵,会增加磨练成本。

一般说来有机溶剂中的气体易脱除,而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法,这种一连脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵,难于普及。

(2)真空脱气:也是比力常用的脱气方法。现在多数企业都最常用这种措施,贮液器被抽成部门真空,溶入的气体蒸发形成气泡溢出,其效果仅次于氦气脱气。象Agileng1200液相色谱使用的是在线脱气机。

在线脱气只适合脱完气之后的流动相,在使用历程中的微量脱气。(3)超声波脱气:将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10~20min。

这种方法比力轻便,又基本上能满足日常分析操作的要求,所以,现在仍广泛接纳。这种方法只能除去30%的溶解气体,有时还会引起气体溶解度的增加。对氧敏感的检测器不宜用此法。

超声脱气比力好,10~20分钟的超声处置惩罚对许多有机溶剂或有机溶剂/水混淆液的脱气是足够了(一般500ml溶液需超声20~30min方可),关于超声时间问题众说纷纭,各实验室内5~30分钟不等,一般来说流动相组成为无机(缓冲盐溶液)时,5~15分钟即可,流动相为是水和有机容积混淆时,超声时间要相对长一些,这个方法只能除去30%的溶解气体,时间的延长反面效果成正比,且其中气泡对色谱峰基线稳定性与信噪比有一定影响,一般来说影响不大,15min超声即可足够。此法不影响溶剂组成。超声时应注意制止溶剂瓶与超声槽底部或壁接触,以免玻璃瓶破裂,容器内液面不要横跨水面太多。

(4)加热回流脱气:该方法虽然效果很好,可是适用规模较窄。对于有机溶剂或混淆流动相不适适用此法,因为挥发性组分会损失掉,改变流动相的组成。综合来说,用真空抽滤后,再用超声脱气还是最常用的措施,用氦气的方法是效果最好的措施,而在线脱气自己也是真空脱气,但它可以放到仪器上使用,是一种保证性的措施。

A.离线(系统外)脱气法不能维持溶剂的脱气状态,在你停止脱气后,气体立刻开始回到溶剂中。在1~4小时内,溶剂又将被情况气体所饱和。B.在线(系统内)脱气法无此缺点。

最常用的在线脱气法为鼓泡,即在色谱操作前和举行时,将惰性气体喷入溶剂中。严格来说,此方法不能将溶剂脱气,它只是用一种低溶解度的惰性气体(通常是氦)将空气替换出来。

此外另有在线脱气机。5、注意流动相供应不畅流动相用完,管道中吸入气体引起泵压力不稳。

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应经常视察储液器中流动相的量,加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底,储液器盖上留一小孔正好夹住进液管,使其不能上下移动。过滤器阻塞引起管道和泵腔空化,压力不稳。

过滤器被微粒所阻塞或长霉,去掉过滤器后如果系统运转正常,说明已找出问题,换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅,那就需要查查流动相的制备历程,或者换大孔径的过滤器。

不管如何,流动相都需要重新过滤。流速过高、阻力大,造成空化现象,这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min,常会泛起这种现象。使用下列方法解决:(1)使用低流速;(2)换大孔径的过滤器;(3)增加进液管道内径;(4)抬高或加压储液器;(5)不用过滤器,但流动相一定要先过滤;(6)储液器盖子太紧,在储液器内形成真空,打出的流动相不一连。

应松开盖子或留有1mm的漏洞;(7)进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液,注意调整进液管道或更换新的。其它问题包罗渗漏或讨论松动、泵部件损坏等,都能引起供液不正常。6、注意防止流动相和储液器被污染由于污染,噪音越来越大,检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统,而再以稳定的浓度流出来,所以在色谱图中不出多余的峰。

用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶,流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高,都是因为重复加进新的流动相或系统用得太久(通宵)所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉,繁殖了细菌。脏的储液器会污染清洁的流动相。

每种流动相备有专用的储液器,或者定期报废储液器。流动相污染来自这几个方面:试剂质量不高,玻璃器皿不及格;微生物的影响;配制流动相时操作不妥等,因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂。

要注意玻璃器皿按划定清洗洁净;为防止微生物生长,天天要用甲醇清洗系统;怀疑系统内生长了微生物,可用稀硝酸冲洗即可(注意不要损坏柱和管道系统);真空脱气时防止泵油带入流动相;用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相;已经污染的流动相一定要废弃掉。7、注意选择流动相应不改变填料的任何性质低交联度的离子交流树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩,从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。

8、选择流动相应注意纯度色谱柱的寿命与大量流动相通过有关,特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。9、选择流动相应注意必须与检测器匹配使用UV检测器时,所用流动相在检测波长下应没有吸收,或吸收很小。当使用示差折光检测器时,应选择折光系数与样品差异较大的溶剂作流动相,以提高敏捷度。

10、选择流动相应注意粘度要低(应<2cp):高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质,降低柱效,还会使柱压降增加,使分散时间延长,最好选择沸点在100℃以下的流动相。11、选择流动相应注意对样品的溶解度要适宜如果溶解度欠佳,样品会在柱头沉淀,不光影响了纯化分散,且会使柱子恶化。

12、选择流动相应注意样品易于接纳应选用挥发性溶剂13、选择流动相应注意由强到弱一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)举行试验,这样可以很快地获得分散效果,然后凭据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。14、选择流动相应注意三倍规则每淘汰10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量,保留因子约增加3倍,此为三倍规则。这是一个智慧而又省力的措施。

调整的历程中,注意视察各个峰的分散情况。15、选择流动相应注意粗调转微调当分散到达一定水平,应将有机溶剂10%的改变量调整为5%,并据此规则逐渐降低调整率,直至各组分的分散情况不再改变。16、流动相的配制注意有机溶剂和水性溶剂的混淆方法有机溶剂和水性溶剂的混淆液作为流动相是经常的,但由于混淆方法差别,有时分析效果相差很大。

如20mM磷酸钠缓冲液(pH2.5)90%与乙腈10%的混淆液,混淆比为9∶1时,20mM 磷酸钠缓冲液(pH2.5)90%与乙腈10%的体积比为9∶1,也就是可以解释为各自按体积比例的相当量称取后举行混淆。另外,按10%乙腈解释,用20mM 磷酸钠缓冲液(pH2.5),将乙腈稀释调制也可以建立。

在后者情况下,发生混淆体积淘汰部门,余下的添加20mM 磷酸钠缓冲液。两者虽然没有太大的差异,但由于混淆方式差别,分析效果,特别是保留时间,也会有显著的差异,这点必须注意。17、50%或(V/V=1/1)乙腈水溶液的配制方法对于用V/V=1/1的表现配制乙腈水溶液,多按这种方法举行:用量筒测定乙腈500mL,用另一量筒测定水500mL,两种液体在瓶内充实摇晃混淆。

不外50%乙腈水溶液的表现时,同样也多是按上述方法配制,但查化学辞典时,实际上是按这种方法举行配制:首先将500mL乙腈,注入1L的量瓶中,量瓶边搅拌边加水,等候液温到达室温,用全量水,使溶液到1L。这样一来,用%表现和“V/V”体积比表现,最终得出的流动相组成差别。也就是说,混淆溶剂的密度,与由原溶剂密度盘算的单纯平均值不相同,所以用上述两种方法调制的流动相组成差异。

如在室温(25℃)四周水50mL和乙腈50mL混淆时体积不是100mL,而有所淘汰,约为96mL。在一般情况下,多用操作轻便的第一种方法。18、流动相的配制注意溶剂体积的温度影响溶液的密度受周围温度的影响。刚从溶剂冷藏箱拿出来的溶液温度与实验室的室温相比,要低不少,乙腈和水混淆液因发烧反映,溶液温度升高。

因此,为能调制再现性好的流动相,建议在使用前用恒温水浴锅将液温调到靠近室温。19、流动相的配制注意用两台泵举行溶剂混淆双泵主要是在探讨流动相的配比或者梯度洗脱是比力利便,知道确切的液相色谱仪条件时,建议配好后使用的话,混淆比力匀称,效果较好。在反相分析中,常用的有机溶剂和水的等浓度法,使用高压两元梯度系统,用两台泵将流动相划分输液后混淆等关闭式混淆时与预先在瓶内混淆后用1台泵输液时,因混淆后体积变化的差别,保留时间也有所差别,一定要注意。

不仅是流动性的调制方法,试样溶液和其他溶液的调制也经常有上述问题,另外,在差别部门(医药部门或化工部门)各自都有自己的知识和习惯。在这种情况下,就要求各部门在制作相关溶液配制方法时能划定通则,界说设计溶液的调制方法,这样制止杂乱,以在日常事情中更好地记着这些表现方法。20、注意流动相的PH 如需在一定PH值下操作,须定期测定流动相的PH值,大气中的CO2溶解在流动相内将引起PH值的改变,特别是贮液瓶密闭不严时这种影响可能更大。

21、注意更换柱子及流动相软质或半软质填料的溶胀率随溶剂极性的变化而变化,使用新柱时应先用25~30倍柱容积的合适流动相平衡。更换流动相时,如果两种流动相不互溶,需接纳过渡溶剂使前一种流动相逐步溶排除去。

例如,2、2、4-三甲基戊烷换成甲醇时,必须用乙酸已酯或其他溶剂过渡,直到尺度物保留值到达稳定状态。(内容泉源:蒲公英 由小析姐整理编辑)。


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